.svg){kind=small}
Eksperimentalna biofizika kompleksnih sistemov in slikanje v biomedicini
- O programski skupini
- Člani
- Oprema skupine
Vodja: prof. dr. Janez Štrancar
Šifra: P1-0060
Trajanje: 1.1.2015-31.12.2018 in 1.1.2019-31.12.2024
Predhodna obdobja:
1.1.2009–31.12. 2014; vodja: prof. dr. Igor Serša; Naslov: Eksperimentalna biofizika kompleksnih sistemov
1.1.2004–31.12. 2008; vodja prof. dr. Janez Štrancar; Naslov: Eksperimentalna biofizika kompleksnih sistemov
Mednarodne povezave: Elettra Sinhrotron Trst (I)
Institut za biofiziko in raziskave nanosistemov (A)
Univerza v Wageningnu (NL)
Mayo Clinic, Rochester MN, (ZDA)
The University of Utah, Salt Lake City UT, (ZDA)
Spletna stran: Obiščite stran
Programska skupina Eksperimentalna biofizika kompleksnih sistemov in slikanje v biomedicini združuje raziskave procesov in struktur bioloških sistemov z razvojem novih naprednih eksperimentalnih tehnik superločljivih mikroskopij, mikrospektroskopij in nanoskopij ter novih slikovnih tehnik. Glavno žarišče raziskav je odziv molekularnih in supramolekularnih struktur na interakcije med materiali in živimi celicami ter med svetlobo in živimi celicami. Zanimajo nas molekularni dogodki in fizikalni mehanizmi, s katerimi so ti dogodki med seboj povezani, časovne skale, pogoji ter aplikativna vrednost raziskovanih mehanizmov, predvsem za uporabo v medicini oz. na področju zagotavljanja zdravja nasploh. Z razvojem novih sklopljenih superločljivih in spektroskopskih tehnik želimo odpreti nove možnosti spoznavanja biloških sistemov in od tam naprej odpirati nove možnosti za načrtovanje medicinskih materialov in naprav, za diagnostiko, terapijo ter regeneracijo tkiv, ki je med starajočim se prebivalstvom razvitega sveta med najbolj perečimi problemi. Skupina po zaključeni investiciji v nov superločljiv STED sistem obvladuje različne fluorescenčne mikroskopije: superločljivo (STED) mikroskopijo in dvofotonsko (2PE) mikroskopijo, večkanalno spektralno-razločeno slikanje življenskega časa fluorescence (spFLIM), fluorescenčno mikrospektroskopijo (FMS), optično pinceto, s katerimi raziskujemo interakcije predvsem med nanomateriali ter celičnimi linijami, ki vodijo v fenomene lipidnega ovijanja in pasivacije nanomaterialov, membranske dizintegracije in prestavljanja celičnih membran brez vloge receptorjev oz klasičnih signalnih poti. Uvedli smo tudi metodo, ki omogoča spremljanje električnega polja v tumorjih pri zdravljenju rakavih obolenj z elektroporacijo, in nadalje razvili metodo multiparametričnega slikanja z magnetno resonanco za karakterizacijo hrane in zdravil ter različnih procesnih postopkov. Z magnetnoresonančnim slikanjem visoke ločljivosti lahko spremljamo učinkovitost površinskih obdelav, nastajanje in raztapljanje gelov kot tudi merjenja difuzije v omejenih geometrijah z moduliranimi gradienti.
| Ime in priimek | Vloga | Laboratorij | Št. sobe |
|---|---|---|---|
| Janez Štrancar | Vodja programske skupine | LBF | J109 |
| Franci Bajd | Raziskovalec | MRI | |
| Tilen Koklič | Raziskovalec | LBF | |
| Boštjan Kokot | Raziskovalec | LBF | |
| Hana Kokot | Raziskovalec | LBF | |
| Benjamin Koroševič Koser | Mladi raziskovalec | LBF | |
| Mojca Urška Mikac | Raziskovalka | MRI | J418A, 009A |
| Aleš Mohorič | Raziskovalec | ||
| Rok Peklar | Mladi raziskovalec | MRI | |
| Ana Sepe | Tehnica | MRI | 009A, C304 |
| Igor Serša | Vodja laboratorija | MRI | J418A, 009A |
| Cody Tripp | Tehnik | LBF | |
| Iztok Urbančič | Raziskovalec | LBF | J107 |
Laboratorij za gojenje bakterijskih kultur
Oprema: laminarij C2, inkubator, stresalniki, avtoklav, digestorij, spektrofotometer, centrifuga, fluorescenčni mikroskop Nikon s programsko opremo za štetje celic in različni objektivi ter računalniško krmiljeno mizico
Laboratorij za gojenje evkariontskih celic
Oprema: laminarij, inkubator, ultracentrifuga, hladilnik -70˘C, drobna oprema
Rotacijski odparjevalnik Buchi R-200
Rotacijski odparjevalnik za pripravo spinkih filmov in suspenzij membran (liposomov) na vodno črpalko z avtomatskih krmiljenjem in regulacijo tlaka
Transmisijski elektronski mikroskop Philips 301 (dotrajan)
UV-VIS spektrofotometer Perkin-Elmer Lambda 17
Pomembnejši raziskovalni dosežki
- 2021
- 2020
- 2019
- 2018
Leta 2018 smo v reviji Nano Letters predlagali vzročno zvezo med vdihavanjem nanodelcev ter boleznimi srca in ožilja na podlagi prisotnosti koagulacijskih encimov: tkivnega faktorja in faktorja X ter lipidov plazemske membrane v koroni nanodelcev TiO2 po izpostavljenosti pljučnim epitelnim celicam. Za dodatno razjasnitev vloge lipidov pri aktivaciji faktorja X smo uporabili topne oblike PS in PE (1,2-dikaproil-sn-glicero-3-fosfo-l-serin (C6PS) in 1,2-dikaproil-sn glicero-3-fosfo-etanolamin (C6PE). Ugotovili smo, da se dve molekuli vsakega lipida neodvisno vežeta na faktor VIIa, s konstanto disociacije okoli 150 µM, kar poveča hitrost aktivacije faktorja X za približno 100-krat v prisotnosti topnega tkivnega faktorja.
Da bi se izognili eksperimentalnim artefaktom zaradi slabo fluorescenčno označenih nanodelcev kovinskih oksidov – največja subpopulacija nanodelcev glede na industrijsko proizvodnjo in število aplikacij – pri slikanju živih celic, smo uvedli niz eksperimentalnih metod, ki omogočajo fluorescenčno označevanje brez artefaktov, in pokazali njihovo uporabo v primeru nanocevk TiO2. Preverili smo potencialne spremembe površinskega naboja in morfologije nanodelcev, ki se lahko pojavijo med označevanjem z uporabo meritev zeta potenciala in transmisijske elektronske mikroskopije, ter ocenili stabilnost vezave fluorescenčnega barvila na nanodelce z meritvami intenzivnosti fluorescence ali z uporabo fluorescenčne korelacijske spektroskopije, kar zagotavlja zanesljivo lokalizacijo nanodelcev znotraj živih celic. Delo je bilo objavljeno v Kokot, Boštjan, Kokot, Hana, Umek, Polona, Van Midden, Katarina Petra, Pajk, Stane, Garvas, Maja, Eggeling, Christian, Koklič, Tilen, Urbančič, Iztok, Štrancar, ”Janez How to control fluorescent labeling of metal oxide nanoparticles for artefact-free live cell microscopy”, Nanotoxicology, ISSN 1743-5404, 2021, vol. 15, no. 8, str. 1102−1123, doi: 10.1080/17435390.2021.1973607.
V okviru industrijskega sodelovanja z našim odcepljenim podjetjem Infinite, d. o. o., smo pri izpostavitvi in vitro pljučne bariere v živo s superločljivo mikroskopijo opazovali zgodnje dogodke, ki prehitevajo karanteno nanomaterialov in bi lahko postali ključni dogodki za še hitrejše napovedovanje dolgoročnih zdravstvenih zapletov. Med njimi smo odkrili t. i. surfanje nanomaterialov in nastanek lukenj, za katere pa še iščemo povezave z drugimi znanimi povezavami. Dodatno smo nadgradili fluorescenčne mikroskope z možnostjo detekcije v nazaj sipani svetlobi, s katero omogočimo sledenje nanomaterialom brez označevanja.
V okviru dveh doktorskih projektov smo uspešno razvili koncept novih doz, ki nadgrajujejo koncept lokalne doze z informacijami o lokalnih interakcijah, ter opazovali spremembe nevrokultur ob izpostavitvi nanomaterialov, kjer se je še bolj kot v primeru izpostavitve pljučne bariere pokazal pomen celic imunskega sistema. Zdi se, da so slednje absolutno ključne za preživetje nevronov.
Uspešno raziskovalno delo, ki smo ga opravljali v okviru sodelovanja na projektu ARRS, Prostorsko in časovno oblikovanje laserske svetlobe za minimalno invazivne oftalmološke posege (L2-9254), smo nadgradili z objavo v ugledni znanstveni reviji na tem raziskovalnem področju (Podlipec, Rok, Mur, Jaka, Petelin, Jaka, Štrancar, Janez, Petkovšek, Rok. ”Method for controlled tissue theranostics using a single tunable laser source”, Biomedical optics express, ISSN 2156-7085, 2021, vol. 12, no. 9, str. 5881-5893, doi: 10.1364/BOE.428467). V njej poročamo o novi teranostični metodi za detekcijo učinka laserske terapije na očesnih tkivih v realnem času na osnovi meritev in analiz življenjskega časa fluorescence ter uporabi zmogljivega adaptivnega 2-fotonskega laserskega sistema, razvitega v Laboratoriju za fotoniko in laserske sisteme (FOLAS), Fakultete za strojništvo, Univerze v Ljubljani. Za raziskovalno delo v okviru ARRS-projekta L7-7561 so dodeljenemu evropskemu patentu (EP3755994B1) v letu 2021 dodali še uradno objavo.
V okviru sodelovanja z Laboratorijem za toplotno tehniko (LTT), Fakultete za strojništvo in Katedro za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo smo na področju detekcije in analize temperaturne dinamike pri procesu mikrovrenja nadaljevali in izvedli nove raziskave z novimi metodami priprave in novimi kombinacijami razvitih temperaturno občutljivih organskih in anorganskih molekul. Na podlagi izsledkov raziskav načrtujemo znanstveno objavo v letu 2022.
V sklopu projekta Crossing Borders and Scales (CROSSING) smo nadaljevali raziskave novih pristopov in optimizacijo protokolov za korelativno mikroskopijo na relevantnih bioloških sistemih z uporabo še več visoko ločljivih mikroskopij in spektroskopij (sihrotron XRF, krio micro-PIXE ipd.) z že obstoječimi. Za proučevanje mehanizmov, ki pripeljejo do kroničnega vnetja pljučnega epitelija zaradi izpostavitve nanodelcev, smo časovnim dinamikam interakcije, pomerjenih na živih sistemih, dodali še meritve časovne dinamike z visoko ločljivo HIMmikroskopijo.V sodelovanju z Odsekom fizike nizkih in srednjih energij (F2) ter Oddelkom za ortopedijo Univerzitetnega kliničnega centra Maribor smo izvedli študijo za razumevanja negativnega vpliva kovinskih drobcev kolčnih protez na okoliško tkivo pri obrabi ali poškodbah, ki bi lahko privedle do imunskega odziva. Z uporabo nekaj najnaprednejših visoko ločljivih in občutljivih mikroskopij ter spektroskopij, ki so na voljo na IJS in HZDR, smo med drugim neposredno ugotovili oksidativni stres kot posledico interakcije s kovinskimi delci, ki lahko povzroča kronično vnetje, in študijo pred kratkim tudi objavili (Podlipec, Rok, Punzón Quijorna, Esther, Pirker, Luka, Kelemen, Mitja, Vavpetič, Primož, Kavalar, Rajko, Hlawacek, Gregor, Štrancar, Janez, Pelicon, Primož, Fokter, Samo K., ”Revealing inëammatory indications induced by titanium alloy wear debris in periprosthetic tissue by label-free correlative high-resolution ion, electron and optical microspectroscopy”. Materials, ISSN 1996-1944, 2021, vol. 14, issue 11, str. [1-16], doi: 10.3390/ma14113048).Z uporabo komplementarnih slikovnih metod smo sodelovali tudi v objavljeni študiji proučevanja vpliva toksičnih nanodelcev na sladkovodne organizme in objavili članek Schymura, Stefan, Drev, Sandra, Podlipec, Rok, Rijavec, Tomaž, Lapanje, Aleš, Štrok, Marko, et al. ”Dissolutionbased uptake of nanoparticles by freshwater shrimp: a dualradiolabelling study of the fate of anthropogenic cerium in water organisms”. Environmental science, Nano, ISSN 2051-8161, 11 str., doi: 10.1039/d1en00264c.
Nadalje smo razvijali napredne mikroskopske in mikrospektroskopske tehnike ter jih uporabili pri raziskavah različnih molekularnih in celičnih mehanizmov. Z evropijem dopirane nanodelce TiO2 smo uporabili kot znotrajcelične temperaturne senzorje, objava v članku Urbančič, Iztok, et al. ”Aggregation and mobility of membrane proteins interplay with local lipid order in the plasma membrane of T cells”, FEBS Letters 2021, 20 str. ISSN1873-3468. DOI: 10.1002/1873-3468.14153.V sodelovanju z Univerzo v Oxfordu (VB) smo odkrili, kako membranski lipidi in proteini sodelujejo pri aktivaciji T-celic; prispevek je bil izbran za naslovnico priznane revije in objavljen v članku Havrdová, Markéta, Urbančič, Iztok, Bartoň Tománková, Kateřina, Malina, Lukáš, Štrancar, Janez, Bourlinos, Athanasios B., ”Self-targeting of carbon dots into the cell nucleus: diverse mechanisms of toxicity in NIH/3T3 and L929 cells”, International journal of molecular sciences 2021, vol. 22, no. 11, str. 5608-1-5608-16. ISSN 1661- 6596. DOI: 10.3390/ijms22115608. S kolegi z Univerze v Olomoucu (CZ) smo raziskovali internalizacijo ogljikovih nanodelcev kot potencialnih protitumorskih agensov ( Biagiotti, Giacomo, Purić, Edvin, Urbančič, Iztok, Krišelj, Ana, Weiss, Matjaž, Mravljak, Janez, Gellini, Cristina, Lay, Luigi, Chiodo, Fabrizio, Anderluh, Marko, et al. ”Combining cross-coupling reaction and Knoevenagel condensation in the synthesis of glyco- BODIPY probes for DC-SIGN super-resolution bioimaging”, Bioorganic chemistry 2021, vol. 109, str. 1−10, ilustr. ISSN 0045-2068, doi: 10.1016/j. bioorg.2021.104730). Sodelovali smo tudi pri razvoju nove fluorescenčne probe za opazovanje imunskih celic s superločljivo mikroskopijo STED.
Slika 1. Primeri petih zgodnjih molekularnih dogodkov v živih epitelijskih celicah po izpostavljenosti nanomaterialu (nanocevke TiO2 označene rdeče), detektiranih s konfokalno oz. STED fluorescenčno mikroskopijo. Drugi kanali so odvisni od primera do primera (zeleni).
Študija o magnetoliposomih kot kontrastnih sredstvih za MRI in sistemih za dostavo zdravil
Laboratorij za slikanje z magnetno resonanco je s partnerji z Oddelka za nanostrukturne materiale (K7, JSI) in tujimi partnerji izvedel večjo študijo o vplivu blokade proteina programirane celične smrti (PD1) na terapevtsko učinkovitost novih temperaturno občutljivih liposomov, napolnjenih z doksorubicinom. Raziskani so bili nizko temperaturno občutljivi magnetoliposomi za učinkovito dostavo zdravil, ki jih je mogoče fototermično aktivirati. Ti magnetoliposomi delujejo tudi kot kontrastna sredstva za slikanje z magnetno resonanco. Magnetoliposomi so bili pripravljeni tako, da so imeli v lipidni dvosloj vgrajene prevlečene nanodelce železovega oksida (IO NP) in v njihovo notranjost vstavljeno še zdravilo proti raku doksorubicin. Naša vloga v študiji je bila karakterizacija NMR relaksacijskih lastnosti magnetoliposomov in slikanje kopičenja magnetoliposomov v tumorjih miši. Študija je pokazala, da so ti magnetoliposomi učinkovita T2 kontrastna sredstva z visoko transverzalno relaksivnostjo r2=333 mM-1s-1. Odlične lastnosti magnetoliposomov kot MRI kontrastnega sredstva omogočajo učinkovito vodenje doziranja zdravila in s tem učinkovitejše zdravljenje tumorja. Rezultati te študije so bili objavljeni v ugledni reviji v članku: Ma Guanglong, Kostevšek Nina, Markelc Boštjan, Hudoklin Samo, Erdani-Kreft Mateja, Serša Igor, Čemažar Maja, Marković Katarina, Ščančar Janez, et al. ”PD1 blockade potentiates the therapeutic efficacy of photothermally-activated and MRI-guided low temperature-sensitive magnetoliposomes”, Journal of controlled release, ISSN 0168-3659, 2021, vol. 332, 45 str., str. 419-433, doi: 10.1016/j.jconrel.2021.03.002. Vključeni smo bili tudi v podobno študijo, kjer smo liposome zamenjali z membranami eritrocitov z vgrajenimi nanodelci železovega oksida.
Ta študija je bila objavljena v članku: Kostevšek Nina, Miklavc Patricija, Kisovec Matic, Podobnik Marjetka, Al-Jamal Wafa, Serša Igor, ”Magnetoerythrocyte membrane vesicles’ superior T2 MRI contrast agents to magneto-liposomes”, Magnetochemistry, ISSN 2312-7481, 2021, vol. 7, no. 4, str. 51-1-51-14, doi: 10.3390/magnetochemistry7040051.
Slika 2. Poškodovana stebla češnjevega lovorja (Prunus laurocerasus) 8., 76. in 151. dan po mehanski poškodbi: (a, e, i) stanje na dan vzorčenja; (b, f, j) prepolovljeni vzorci na spodnjem (BOT) in zgornjem (TOP) delu; (d, h, l) radialni profil vsebnosti vlage, izračunan iz vrednosti intenzivnosti slikovnih pik MRI,(c, g, k) magnetnoresonančne (MRI) slike poškodovanih stebel.
Korelacije med izidom zdravljenja bolnikov z ishemično možgansko kapjo z rentgenskimi lastnostmi njihovih trombovVsi bolniki s sumom na možgansko kap so napoteni na CT celotnih možganov, ki se uporablja predvsem za iskanje zgodnjih značilnosti ishemije in za lociranje okluzije in njene velikosti, medtem ko so vrednosti rentgenskih enot Hounsfield (HU) tromba, ki povzroča možgansko kap, običajno spregledane. V tej študiji smo pokazali, da je vrednost HU pomembna in lahko pomaga pri boljšem načrtovanju zdravljenja možganske kapi. V študijo so bili vključeni bolniki z diagnozo ishemične možganske kapi na območju srednje možganske arterije (MCA). Pri vseh bolnikih sistemska tromboliza ni bila uspešna in je bila potrebna mehanska rekanalizacija. Odvzete trombe smo histološko analizirali tudi za določitev deleža rdečih krvnih celic (RBC). CT proksimalnega segmenta MCA smo analizirali in določili povprečno vrednost HU in njeno variabilnost tako v okludiranem delu kot v simetričnem normalnem mestu. Ugotovljene so bile relevantne pozitivne korelacije med povprečno vrednostjo HU tromba in izidom zdravljenja, ovrednotenim z modificirano Rankinovo lestvico (mRS), začetnim mRS, številom prehodov z napravo za trombektomijo in deležem RBC. Ta študija je bila objavljena v članku: Viltužnik Rebeka, Vidmar Jernej, Fabjan Andrej, Jeromel Miran, Miloševič Zoran, Kocijančič Igor, Serša Igor, ”Study of correlations between CT properties of retrieved cerebral thrombi with treatment outcome of stroke patients”, Radiology and oncology, ISSN 1318-2099. 2021, vol. 55, iss. 4, 409-417 str., doi: 10.2478/raon-2021-0037.
Slikanje z magnetno resonanco kot orodje za spremljanje odziva tkiv na obdelavo s pulzi električnega poljaCilj te študije je bil raziskati permeabilizacijo celičnih membran v rastlinski in živalski hrani (krompir, jabolka, piščanec), ki je posledica obdelave s pulzi električnega polja. Študija je bila izvedena pri različnih amplitudah električnih pulzov, rezultati pa so bili izraženi s spremembami električnih lastnosti tkiv, ovrednotenih z električno impedančno spektroskopijo, tokovno-napetostnimi meritvami in s slikanjem z magnetno resonanco. Slikali smo spremembe v porazdelitvi vode in v T2 NMR relaksacijskih časih. Ugotovitve naše raziskave bi lahko bile v pomoč pri ustrezni izbiri metode ocenjevanja učinka elektroporacije glede na značilnosti živil. Ta študija je bila objavljena v članku: Genovese Jessica, Kranjc Matej, Serša Igor, Petracci Massimiliano, Rocculi Pietro, Miklavčič Damijan, Mahnič-Kalamiza Samo, ”PEF-treated plant and animal tissues: insights by approaching with different electroporation assessment methods”, Innovative food science & emerging technologies, ISSN 1466-8564, 2021, vol. 74, 102872, str. 1−9, doi: 10.1016/j.ifset.2021.102872.
Slika 3. Nizko temperaturno občutljivi magnetoliposomi kot učinkovita T2 NMR kontrastna sredstva in vivo. Mišim s tumorji CT26 smo intravensko injicirali prevlečene nanodelce železovega oksida (HCA-IO NP) ali nizko temperaturno občutljive magnetoliposome z vgrajenimi prevlečenimi nanodelci železovega oksida (mLTSL) pri odmerku 50 μg Fe na miš. Po injiciranju smo na en tumor za 50 minut zalepili magnet in nato obsevali z laserjem (808 nm, 0,3 W/cm2) za 10 minut (+M, +L). Drugi tumor ni bil izpostavljen magnetu in ni bil obsevan (-M, -L). T2-obtežene slike so bile posnete 1 uro in 24 ur po injiciranju. Rdeča in rumena puščica označujeta temnejši kontrast pri zdravljenih tumorjih (+M, +L), injiciranih z mLTSL oziroma s HCA-IO NP. Zelene puščice označujejo nezdravljene tumorje (-M, -L). T2-obtežene MR slike so bile posnete z uporabo zaporedij za MR slikanje s spinskim odmevom pri parametrih TE/TR = 40/3000 ms.
Epidemiološki dokazi kažejo, da vdihavanje onesnaženega zraka, vključno z nanodelci, prispeva k približno 4 milijonov smrtnih žrtev po vsem svetu. Še vedno pa ni znano, kateri nanodelci so za to odgovorni. V sodelovanju z Nacionalnim raziskovalnim centrom za delovno okolje (NRCWE) (Danska) smo pokazali, da so med več različnimi vrstami anataznih TiO2nanodelcev le nanocevke sprožile kronično vnetje pri miših [1].
Po našem odkritju leta 2019, da epitelijske celice na svoji površini pasivirajo nekatere nanomateriale, kar zmanjšuje uničujoč učinek interakcij med nanomateriali in različnimi strukturami v celicah (npr. jedro, aktinski citoskelet, notranje membrane; vse opaženo z mikroskopijo STED), smo prvi na svetu razvili model, ki brez uporabe živali napove kronično vnetje, povzročeno z vdihom nanodelcev. Napoved temelji na zapletenem mehanizmu, ki je bil odkrit v okviru intenzivnih skupnih raziskav znotraj delovnega paketa, ki smo ga vodili v okviru evropskega Horizont 2020 projekta SmartNanoTox, vrednega 8 milijonov evrov. Mehanizem toksičnosti nanomaterialov temelji na treh ključnih dogodkih: 1) tvorjenje aglomeratov nanodelcev in biomolekul na površini celic pljučnega epitelija, 2) toksičnost delcev za makrofage in 3) celična signalizacija, pri čemer so vsi povezani v krog dogodkov. Delo, objavljeno v ugledni reviji Advanced Materials (IF 27, A’’) [2], je urednik posebej izpostavil (naslovnica poglavja – frontispiece) in se trenutno uvršča med 5 % najbolj uspešnih rezultatov raziskav glede na Altmetric. Omenjeno ogromno skupno raziskavo sta vodila naša raziskovalca T. Koklič in J. Štrancar (dva od treh dopisnih avtorjev), med soavtorji članka pa so tudi vodilni svetovni toksikologi iz Nemčije, Francije Danske, Kanade, Finske, Švedske, Irske in Združenega Kraljestva.
V sodelovanju z Univerzo v Oxfordu (VB) razvijamo napredne mikrospektroskopske metode za opis lokalnega molekularnega okolja. Super-ločljivi fluorescenčni korelacijski spektroskopiji (STED-FCS) smo izboljšali prilagodljivost z vgradnjo hitrejše detekcijske elektronike [3]. Z vpeljavo na aberacije odporne oblike STED žarka smo izboljšali zanesljivost meritev STED-FCS v 3D [4], s prilagodljivo optiko pa smo raziskovali difuzijske lastnosti molekul v zahtevnem celičnem okolju [5]. Raziskovali smo tudi nove probe za super-ločljivo mikroskopsko tehniko RESOLFT [6]. Za nadaljnje raziskave na področju naprednih mikrospektroskopij smo pridobili in začeli izvajati nov ARRS projekt (J7-2596) v sodelovanju z Laboratorijem za umetne vizualne spoznavne sisteme (VICOS) s Fakultete za računalništvo in informatiko Univerze v Ljubljani.
Izsledke raziskovalnega dela, ki smo ga opravili v okviru projekta ARRS Mikrospektroskopska karakterizacija in optimizacija učinka laserskih sunkov na očesni mrežnici (L7-7561), smo v 2020 objavili v dveh znanstvenih publikacijah [7,8]. V njih poročamo o zmogljivostih razvitega 2-fotonskega laserskega sistema (Laboratorij za fotoniko in laserske sisteme (FOLAS), Fakulteta za strojništvo kot partner LBF) za diagnostiko patologij in izvajanja terapije na mrežnici ter zmogljivostih fluorescenčnega hiperspektralnega slikanja z uporabo napredne analize za proučevanje dinamike koagulacije in oksigenacije krvi izvedeno na ex-vivo mrežnici. Obsežno delo na omenjenih projektih smo poleg publikacij predstavili v dodeljenem evropskem patentu (PCT/SI2018/050007, EP2018713384).
V okviru tekočega projekta ARRS (L2-9254) smo naš STED laserski sistem nadgradili z novo optično linijo za testiranje novo razvitega adaptivnega laserskega sistema (Laboratorij za fotoniko in laserske sisteme (FOLAS), Fakulteta za strojništvo kot partner LBF). Na ex-vivo mrežnici smo testirali in opredelili diagnostične in terapevtske zmogljivosti laserja, skupaj z novo razvitim algoritmom in konceptom učinkovite teranostike. Izsledke raziskave bomo objavili v letu 2021.
V okviru sodelovanja LBF z Laboratorijem za ogrevalno tehnologijo LTT, Fakulteta za strojništvo, na področju detekcije in analize temperaturne dinamike pri procesu mikro-vrenja, smo v letu 2020 izvedli nove raziskave. Za detekcijo temperature pri procesu mikro-vrenja smo preizkusili različne kombinacije novo razvitih temperaturno občutljivih organskih in anorganskih molekul ali delcev. Na osnovi preliminarnih rezultatov smo vzpostavili novo sodelovanje z Oddelkom za napredne materiale (K9) za nadaljnje eksperimentalno delo v letu 2021.
Veliko dela smo namenili tudi tekočemu projektu Crossing Borders and Scales (CROSSING) fokusiranem na napredno korelativno mikroskopijo (CM) z uporabo najsodobnejših visoko ločljivih mikroskopskih in spektroskopskih tehnik, ki jih ponujata partnerski instituciji IJS in HZDR. Nadaljevanje raziskav vpliva nanomaterialov na relevantne biološke sisteme (model pljučnega epitelija, nevronska mreža), je pomembno prispevalo k izsledkom raziskave objavljene v ugledni reviji [2] in tudi k boljšemu razumevanju molekularnih dogodkov v okviru toksikoloških študij. Preizkusili in začrtali smo nove napredne analitične pristope in smernice CM dostopne na IJS in partnerskih institucijah, da bi v prihodnje še bolje razumeli mehanizme interakcij omenjenih kompleksnih bioloških sistemov.
V letu 2020 smo bili v Laboratoriju za biofiziko dejavni tudi v sklopu notranjih IJS razpisov. Oddali smo vlogo za vključitev laboratorija v prijavo Infrastrukturnega programa (IP) za obdobje 2022–2027. Na podlagi ekspertnega znanja in razpoložljive infrastrukture naprednih in multimodalnih optičnih mikroskopij smo v sodelovanju z nekaterimi oddelki IJS oddali vlogo za novi center, imenovan Center za napredne optične mikroskopije, ki bi bil del centra CEMM.
Slika 1. A) Razvoj metode, ki lahko brez živalski testov napove, ali bo vdih nanodelcev povzročil kronično vnetje: B) z uporabo naprednih mikroskopij in omik na in vivo ter in vitro sistemih smo najprej odkrili potek in mehanizem razvoja kroničnega vnetja po izpostavitvi nanodelcev. C) Tako-odkrite dogodke smo kavzalno povezali v mrežo dogodkov, ki je prikazana na poenostavljeni shemi. D) Teoretičen model mreže dogodkov nam je omogočilnapoved vnetja in posledično razvrstitev nanomaterialov v več ustreznih podskupin na podlagi treh merljivih parametrov. E) Ko pomerimo te parametre v ustreznem in vitro sistemu, lahko za poljuben metaloksidni nanomaterial s pomočjo teoretičnega modela časovno- in stroškovno-učinkovito napovemo morebitno kronično vnetje brez testiranja na živalih.
Spremljanje metamorfoze kranjske čebele (Apis mellifera carnica) z MR mikroskopijo
V sodelovanju z Biotehniško fakulteto (BF UL) smo se že poleti 2018 lotili študije spremljanja metamorfoze kranjske čebele s sekvenčno MR mikroskopijo. Študija je bila zahtevna, saj smo morali zagotoviti optimalne pogoje za razvoj čebele znotraj MR magneta med slikanjem, ki je brez prestanka trajalo kar 14 dni za posamezen vzorec čebele. Najprej smo izolirali posamezno celico z ličinko in jo nato slikali do razvoja odrasle čebele. V tem času je bilo s časovnim razmikom 4 ur posnetih približno 80 tridimenzionalnih slik z visoko ločljivostjo 80 mikrometrov. Posnete slike je bilo nato potrebno segmentirati, da smo lahko iz njih izluščili informacijo o časovnem spreminjanju prostornine različnih organov (prebavnega trakta, dihalnega sistema, medenega želodčka …). S pomočjo strukturne analize slik z metodo »gray level cooccurrence matrix«, smo lahko določili tudi transformacijo letalne mišiče. Zaradi statistične dokazljivosti rezultatov smo slikanje izvedli na dveh vzorcih čebel. Rezultate MR slik čebel smo preverili tudi s slikami rentgenske računalniške tomografije posnetih na IJS, na odseku B1 ter tudi s histološko analizo, ki je bila opravljena na BF UL. Rezultate te študije smo objavili v ugledni reviji s področja biologije v članku: Aleš Mohorič, Janko Božič, Polona Mrak, Kaja Tušar, Lin Chenyun, Ana Sepe, Urška Mikac, Georgy Mikhaylov, Igor Serša, “In vivo continuous three-dimensional magnetic resonance microscopy : a study of metamorphosis in Carniolan worker honey bees (Apis mellifera carnica)”, Journal of Experimental Biology, Nov. 2020, vol. 223, iss. 21, 6 str., ilustr., ISSN 0022-0949, DOI: 10.1242/jeb.225250.
Nova metoda za izboljšanje razmerja signal/šum MR slik
Razvili smo novo metodo, s katero lahko izboljšamo razmerje med signalom in šumom v MR slikah. Metoda temelji na pojavu potujitve signala. Ta pri MR slikanju nastopi, ko je vidno polje slikanje manjše od velikosti vzorca. Pojav vodi do popačitve MR slike pri običajnih vzorcih, saj se deli vzorca izven vidnega polja preslikajo nazaj v sliko na nasprotni strani njihove prekoračitve vidnega polja, kar lahko vodi do njihovega motečega prekrivanja s sliko dela vzorca znotraj vidnega polja. Ugotovili smo, da lahko pri posebni vrsti vzorcev, to je pri periodičnih vzorcih ta neželen pojav izkoristimo za konstruktivno superpozicijo potujitvenih signalov in s tem za ojačenje signala brez povečanja šuma, če te vzorce slikamo pri vidnem polju enakem velikosti osnovne celice periodičnega vzorca. Metoda je bila sprva teoretično analizirana, nato preverjena na modelnem vzorcu v dveh dimenzijah in na koncu je bila predstavljena še uporaba te metode na primeru določanja vlažnosti tablet. Pri teh je iz posamezne tablete signala premalo, da bi lahko dobili sliko, s predstavljeno metodo pa je to možno brez težav dobiti. Rezultati te študije so bili objavljeni v članku: Igor Serša, “Magnetic resonance microscopy of samples with translational symmetry with FOVs smaller than sample size”, Scientific reports, 2021, vol. 11, 541-1-541-12, ISSN 2045-2322, DOI: 10.1038/s41598-020-80652-z.
Študij morfologije medialnega in ularnega živca
Na pobudo partnerjev Inštituta za anatomijo (MF UL) smo se lotili primerjalne študije kjer tri radiološke metode primerjamo po njihovem diagnostičnem potencialu ločevanja finih struktur znotraj posameznih živčnih vlaken. Vzorci živčnih vlaken so bili izolirani človeški medialni in ularni živec, v katerih smo hoteli iz njihovih radioloških slik natančno določiti število in velikost posameznih fasciklov. Uporabljene radiološke metode so bile: klinično MR slikanje na 3T sistemu (3T-MRI), visokoločljivo ultrazvočno slikanje (HRUS), magnetno resonančna mikroskopija (MRM) v polju 9.4 T. Slike teh treh metod smo primerjali še z referenčno histološko analizno metodo. Rezultati študije so pokazili, da ima izmed vseh treh radioloških metod največjo diagnostično moč MRM slikanje, temu sledi HRUS in najslabše se je izkazal 3T-MRI. Rezultati te študije so bili objavljeni v vodilni reviji s področja radiologije v članku: Žiga Snoj, Igor Serša, Urša Matičič, Erika Cvetko, Gregor Omejec, “Nerve fascicle depiction at MR microscopy and high-frequency US with anatomic verification”, Radiology, 2020, vol. 297, no. 3, str. 1-3, ISSN 0033-8419, DOI: 10.1148/radiol.2020201910.
Razvoj MR kontrastnih sredstev na osnovi magnetolipososmov
Sodelovali smo pri karakterizaciji MR lastnosti nove vrste kontrastnih sredstev, ki so jih razvili na odseku K7, IJS. Gre za kontrastna sredstva na osnovi superparamagnetnih železovih nanodelcev, ki jih zaradi boljše biokompatibilnosti in terapevtskih možnosti vgradimo v dvoslojno membrano liposomov in tako dobimo magnetoliposome (ML). V študiji smo sprva merili NMR relaksacijske lastnosti različno koncentriranih vodnih raztopin ML. Temu so sledili še poskusi MR slikanja z metodo T2 kartiranja na kulturi zdravih in rakastih (T24) urotelnih celic, ki smo jim dodali ML v različnih koncentracijah. V poskusih smo pokazali, da se ML izraziteje nakopičijo v rakastih celicah, MR signal teh celic je zato precej krajši (T2 -NMR relaksacijski čas se močno skrajša) in s tem je omogočeno učinkovito ločevanje med zdravimi in rakastimi celicami. Izsledki te študije so objavljeni v članku: Nina Kostevšek, Calvin Cheung, Igor Serša, Mateja Erdani-Kreft, Ilaria Monaco, Mauro Comes Franchini, Janja Vidmar, Wafa Al-Jamal, “Magneto-liposomes as MRI contrast agents : a systematic Study of different liposomal formulations”, Nanomaterials, 2020, vol. 10, no. 5, str. 889-1-889-18, ISSN 2079-4991, DOI: 10.3390/nano10050889.
Proučevanje tablet z nadzorovanim sproščanjem zdravilnih učinkovin z MR slikanjem
Proučevali smo vpliv različnih pH in mehanskih obremenitev povzročenih s tokom tekočine na tvorjenje gelske plasti okoli tablet in na sproščanje pentoksifilina iz tablet ksantana. Uporabljena je bila biomodalna metoda, kjer je bilo MR slikanje uporabljeno za spremljanje formiranja gelske plasti okoli tablet, odvzem vzorca medija, v katerem se je tableta raztapljala, pa je omogočal spremljanje sproščanja učinkovine iz tablet. Dobljeni rezultati so pokazali, da je v pH nevtralnem mediju (vodi) struktura gelske plasti šibkejša in manj odporna proti eroziji kot struktura plasti dobljena v kislem mediju. Različne pH vrednosti medija so vplivale tudi na različne mehanizme sproščanja učinkovine iz tablet. Ta je bila pretežno erozijska v primeru nevtralnega medija in difuzijska v primeru kislega medija. Vpliv toka tekočin okoli tablet je bil pomemben pri erozijskem načinu sproščanja pri nevtralnem pH, med tem ko je bil njegov vpliv zanemarljiv v primeru difuzijskega načina sproščanja v kislem pH zaradi povečane kompaktnosti gelske plasti. Rezultati študije so bili objavljeni v članku: MIKAC, Urška, KRISTL, Julijana. Magnetic resonance methods as a prognostic tool for the biorelevant behavior of xanthan tablets. Molecules. 2020, vol. 25, no. 24, str. 1-12, ilustr. ISSN 1420-3049, DOI: 10.3390/molecules25245871.
Slika 2: MR slike metamorfoze kranjske čebele (Apis mellifera carnica) posnete v razmiku dveh dni: (A) T1-obetžene magnetnoresonančne slike srednje rezine iz 3D seta slik, (B) pripadajoče prostorsko upodobljene slike, (C) pripadajoče slike segmentiranega dihalnega sistema in (D) pripadajoče slike segmentiranega prebavnega trakta.
Slika 3: MR slike testnega 2D periodičnega vzorca: (A-C) vzorec tvori samo osrednji objekt dimenzije osnovne celice 7 mm in (D-F) vzorec tvori devet identičnih objektov urejenih v 3×3 matriko. (A, D) Ko je bil osrednji objekt slikan pri vidnem polju (FOV) enakem trikratniku dimenzije osnovne celice, je bil SNR 9-krat višji od primera (B), ko je bil ta objekt slikan pri FOV enakem osnovni celici. Pri slikanju 2D periodičnega vzorca z FOV enakemu osnovni celici se SNR poveča glede na primer (B) za faktor: (E) 3-krat, ko je konstruktivna potujitev signala prisotna samo v fazni smeri in (F) 9-krat, ko je konstruktivna potujitev signala prisotna vzdolž obeh osi simetrije. (C) Sliko enakega SNR kot v primeru (F) je možno dobiti tudi z 81 povprečitvami signalov slike primera (B).
Leta 2018 smo v članku, objavljenem v reviji Nano Letters, s STED mikroskopijo prvič direktno opazovali lipidno ovijanje TiO2 nanocevk v živem pljučnem epiteliju. V sodelovanju s skupino Davida Gomeza na UCD (Dublin, Irska), ki je opravil proteomsko analizo omenjenih lipidnih ovojev, smo pokazali, da v lipidnem ovoju obstajajo ključni encimi, ki bi lahko sprožili nastanek krvnih strdkov. Zato smo v letu 2019 v sodelovanju z Laboratorijem profesorice Rinku Majumder z LSUHSC School of Medicine (New Orleans, ZDA) identificirali ključne celice in vitro sistema, ki bi bil zmožen reproducirati in pojasniti, kako nastane krvni strdek in vivo. To je podlaga za razvoj hipotetične signalne poti z neugodnim izidom (AOP) ter in vitro sistema, ki bi lahko napovedal, kateri nanodelci lahko sprožijo trombozo.
Ključen preboj je bil leta 2019 narejen z odkritjem mehanizma proženja kroničnega vnetja pljučnega epitelija zaradi izpostavljenosti nanomaterialom. S STED in HIM mikroskopijo (delno v sodelovanju s HZDR Dresden) smo namreč ugotovili, da epitelijske celice nekatere nanomateriale pasivirajo na svoji površini, s čimer zmanjšajo uničujoč učinek interakcij med nanomaterialom in različnimi strukturami v celicami (npr. jedro, aktinske mreže, notranje membrane; vse opaženo s STED mikroskopijo). To dosežejo z ojačano sintezo lipidov (dokazano s transkriptomiko in vitro v sodelovanju z HGMU München ter in vivo v sodelovanju z NRCWE Kopenhagen in Health Canada) ter izločanjem agregatov nanomaterialov in lipidov na površino (dokazano s STED mikroskopijo). Žal pa imunske celice, še posebej makrofagi, te agregate prepoznajo kot tujke in umrejo, medtem ko jih poskušajo razgraditi. Zaradi tega se material spet izloči v prostor med celicami, kar pomeni, da se krog sklene – saj je material pripravljen, da ga epitelijske celice spet potegnejo vase. Krog se lahko ponavlja, če se v živem sistemu umrli makrofagi nadomeščajo z novimi, kar se dejansko dogaja zaradi signalizacije s strani epitelijskih celic. Z modeliranjem smo pokazali, da pri določenih kombinacijah hitrosti pasivacije, signalizacije in toksičnosti dejansko dobimo dolgotrajen (kroničen) odziv na enkratno izpostavitev (članek se pripravlja). Obenem pa smo med študijem mehanizma identificirali določene tehnike detekcije omenjenih dogodkov, na podlagi katerih se da narediti senzorske sisteme s sposobnostjo napovedovanja bolezenskih stanj. Ta znanja smo na IJS prijavili kot skrita znanja in ustanovili odcepljeno podjetje Infinite, d. o. o. V sodelovanju z Univerzo v Oxfordu (VB) razvijamo napredne mikrospektroskopske metode za opis lokalnega molekularnega okolja. Superločljivi fluorescenčni korelacijski spektroskopiji (STED-FCS) smo močno izboljšali zanesljivost in prilagodljivost z vpeljavo prilagodljive optike za odpravo optičnih aberacij [1]. Svoje ekspertno znanje STED-FCS smo zaobjeli v podrobnem opisu metode, objavljenem v Nature Protocols [2]. Z okoljsko občutljivimi barvili in mikrospektroskopijami smo nadalje odkrili, da molekularne lastnosti bioloških membran dobro napovejo njihove mehanske lastnosti na mikrometrski ravni, kar smo poročali v Communications Biology (Nature Publishing Group) [3].
Za učinkovitejše označevanje smo raziskali, sintetizirali in preizkusili serijo novih STED fluoroforjev, pri katerih smo iskali zelo nizko stopnjo bledenja za 3D-time-lapse STED mikroskopijo in spremljanje interakcij v 3D. Prav tako je bilo sintetiziranih nekaj parov fluoroforjev za nanotemperaturno mapiranje, da se omogoči profiliranje temperature pri pojavu mikrovrenja, kar se izvaja v sodelovanju s prof. Golobičem s Fakultete za strojništvo Univerze v Ljubljani.
Na podlagi eksperimentalnih rezultatov, doseženih v okviru ARRS projekta (L7-7561), zaključenega v letu 2019, smo razvili novo metodologijo za diagnostiko puščanja žil v očesnih tkivih in zaznavo patoloških stanj na mrežničnem epiteliju. Za namen raziskave smo poleg koncepta razvili in izdelali tudi napredni ter cenovno učinkovit hiperspektralni sistem, ki temelji na detekciji autofluorescence tkiv. Poleg tega smo del raziskav, namenjenih hiperspektralni detekciji koagulacije, povzeli v znanstvenem prispevku (Podlipec et al., Journal of Biophotonics, In submission).
V okviru še enega tekočega ARRS projekta (L2-9254) smo izvedli prve eksperimente teranostike s časovno oblikovanim modularnim laserskim sistemom, razvitim v Laboratoriju za fotoniko in laserske sisteme (FOLAS) na realnem biološkem sistemu. Z razvojem laserskega sistema in njegovo dograditvijo na naš superločljiv STED mikroskop smo na očesnem tkivu uspešno izvedli napredno diagnostiko na osnovi detekcije življenjskega časa fluorescence ter terapetiko na lokalno tarčno področje. Pomembne rezultate študije smo povzeli v znanstvenem prispevku (Podlipec et al, Applied Physics A, In submission).
Del raziskav smo namenili tudi novemu mednarodnemu projektu Crossing borders and scales (CROSSING) med Institutom ”Jožef Stefan” (IJS) in Helmholz-Zentrum Dresden Rossendorf (HZDR), kjer je naša skupina udeležena v prvem od štirih delovnih sklopov, ki pokriva področje korelativne mikroskopije. S kombinacijo visokoločljivega STED in helijevega ionskega mikroskopa (HIM), dostopnega na HZDR, smo posneli prve korelativne slike relevantnega biološkega sistema interakcije nanodelcev na in-vitro sistemu pljučnega epitelija na nanoskali. Več rezultatov in objavo izsledkov študije, ki še poteka, pričakujemo v letu 2020.
Slika 1: Pasivacija TiO2 nanocevk na površini pljučnih epitelijskih celic. A) razvoj bionano aglomeratov (leva slika uro po dodatku nanodelev, desna slika dva dni po dodatku nanodelcev, zelena barva predstavlja membrane, rdeča pa nanomaterial); B) različne povečave bionano aglomeratov na površini epitelijskih celic s STED (barvanje enako kot pri A), HIM in SEM mikroskopijo; številki 1 in 2 označujeta dva vzorca; C) odvisnost nastanka agregatov od doze– vodoravni (zgornja vrsta) in navpični (spodnja vrsta) preseki, dobljeni s STED mikroskopijo, barvanje enako kot pri A.
Uporaba magnetne resonance pri študiji polimernih tablet za kontrolirano sproščanje
Tablete s kontroliranim sproščanjem se zaradi svojih številnih prednosti vse bolj uporabljajo v farmacevtski industriji. Gelska plast, ki se ob stiku tablete, narejene iz hidrofilnega polimera, s telesnimi tekočinami ustvari okoli tablete, regulira prodiranje telesnih tekočin v tableto in tako nadzoruje raztapljanje in difuzijo zdravilne učinkovine iz nje. Zato je poznanje gelske plasti ključnega pomena pri uporabi tablet s kontroliranim sproščanjem. Študije nabrekanja tablet iz ksantana so pokazale, da je nabrekanje odvisno od pH in ionske moči medija, v katerem tableta nabreka. Dinamika gibanja molekul medija in polimernih verig je zelo pomembna za kinetiko sproščanja zdravil iz hidrofilnih tablet, saj vodi do nenehno spreminjajočih se velikosti in porazdelitve por v gelski plasti in s tem difuzijskih poti za zdravilno učinkovino. Dinamiko medija in polimernih verig ksantanovih gelov različnih koncentracij v vodnem in kislem mediju smo določili z magnetno resonančno relaksometrijo s hitrim spreminjanjem magnetnega polja (»Fast-field cycling NMR relaxometry«). Študija je pokazala, da dinamika medija pada z večanjem koncentracije ksantana v gelu, ravno tako pa je odvisna tudi od pH vrednosti medijev. Rezultate smo objavili v članku Urška Mikac, Ana Sepe, Anton Gradišek, Julijana Kristl, Tomaž Apih, Dynamics of water and xanthan chains in hydrogels studied by NMR relaxometry and their influence on drug release, International journal of pharmaceutics, ISSN 0378-5173, 2019, 563, 373−383.
Merjenje dinamike strjevanja cementa z metodo merjenja difuzijskih spektrov
V laboratoriju za slikanje z magnetno resonanco že dalj časa proučujemo različne pristope merjenja difuzije v
porozni snovi. Naš originalni prispevek znanosti na tem področju je razvoj metode merjenja difuzijskih spektrov s pomočjo moduliranih gradientov magnetnega polja. Pri tem za razliko od drugih skupin uporabljamo konstanten gradient, ki pa z dodatkom zaporedja radiofrekvenčnih pulzov za večkratni spinski odmev postane efektivno oscilirajoč in tako omogoča merjenje difuzijske konstante pri frekvenci, določeni z oscilacijo efektivnega gradienta. Metoda ima tudi tehnične omejitve, vezane na frekvenčno sliko radiofrekvenčnih pulzov. Pred leti smo pokazali, kako zaobiti te omejitve na testnih vzorcih, nismo pa še pokazali praktične uporabnosti te metode. V nedavni študiji, objavljeni v članku Igorja Serša, Sequential diffusion spectra as a tool for studying time-dependent translational molecular dynamics : a cement hydration study, Molecules, 2020, 25, no. 1, 68-1-68-15, je bila predstavljena uporaba te metode za spremljanje strjevanja belega cementa.
Razvoj MRI metod za diagnostiko malignega pleuralnega mezoteljoma
Bolezni, povezane z izpostavljenostjo škodljivemu azbestu, so v Sloveniji pogoste. Ena od najhujših oblik teh je
rak popljučnice oziroma maligni pleuralni mezoteljom. Zdravljenje bolnikov s to boleznijo je zelo zahtevno in za spremljanje njegovega poteka je treba imeti tudi dobro slikovno diagnostiko. V tej študiji smo pokazali, da slikanje z magnetno resonanco v povezavi z uporabo kontrastnih sredstev lahko ponuja dobro diagnostično orodje. Analizirali smo dinamiko kopičenja kontrastnega sredstva z različnimi obstoječimi farmakokinetičnimi modeli, določili njihove parametre in nato analizirali njihovo napovedno vrednost tako, da smo primerjali vrednosti parametrov rakastega tkiva z zdravim. Ta študija je bila tudi doktorska tema študentke MPŠ Martine Vivode Tomšič, ki je doktorirala leta 2019 pod somentorstvom prof. dr. Igorja Serša. Iz študije je bil objavljen tudi znanstveni članek Martine Vivoda Tomšič, Sotiriosa Bisdasa, Viljema Kovača, Igorja Serša, Katarine Šurlan Popović, Dynamic contrast-enhanced MRI of malignant pleural mesothelioma: a comparative study of pharmacokinetic models and correlation with mRECIST criteria, Cancer imaging. 2019, 19, no. 1, 1−11.
Ocena kariesa zob in vivo s kartiranjem T2 relaksacijskega časa zobne pulpe
Zobni karies pacientov običajno diagnosticiramo s pomočjo rentgenskega slikanja. Pred leti smo na ekstrahiranih zobeh pokazali, da ima veliko potenciala za oceno kariesa tudi slikanje z magnetno resonanco. To prisotnost kariesa pokaže z na MRI slikah vidno demineralizacijo dentina in spremembami difuzijske konstante ter T2 relaksacijskih časov zobne pulpe. Tedanjo študijo smo sedaj poskusili nadaljevati z in vivo slikanjem kart relaksacijskih časov T2 pacientov s kariesom zob in prostovoljcev z zdravimi zobmi. Pokazali smo, da kljub majhni ločljivosti slik in vivo še vedno dobro ocenimo stopnjo kariesa iz sprememb relaksacijskega časa T2. Te ocene so dale namreč povsem primerljive rezultate s klasično oceno na podlagi mednarodne lestvice kariesa ICDAS. Izsledke te študije smo objavili v članku Ksenije Cankar, Jerneja Vidmarja, Lidije Nemeth, Igorja Serša, T2 mapping as a tool for assessment of dental pulp response to caries progression: in vivo MRI study, Caries Research, 2019, ISSN 0008-6568. DOI: 10.1159/000501901.
Slika 2: T1 utežena slika (a) in ustrezna karta T2 vrednosti (b) bolnika s kariesom zob v sagitalni rezini. V karti T2 sta označeni dve področji zanimanja (ROI) s črtkano črto, eno vsebuje enokoreninski zob, drugo pa molar. Izseka karte T2, ki prikazujeta dve izbrani povečani področji ROI, sta prikazani na slikah (c) in (d). Sliki (e)
in (f) prikazujeta grafa T2 profila vzdolž zobne pulpe, ki sta bila izmerjena vzdolž črtkane črte po sredini pulpe, kot je to naznačeno na izsekih T2 karte.
MR mikroskopija možganskih krvnih strdkov kot orodje za oceno poteka trombektomije
Zdravljenje ishemične možganske kapi se podobno kot pred tem že pri zdravljenju miokardnega infarkta seli od uporabe trombolize k pristopom mehanske odstranitve žilne zapore (krvnih strdkov) s pomočjo katetrskega dostopa. Njena uspešnost je zelo odvisna od krvnega strdka, njegove dolžine, sestave, stopnje retrakcije … Precej teh parametrov ne moremo določiti iz CT rentgenskih slik, ki se posnamejo pri pacientih pred posegom. V tej študiji smo na z mehansko trombektomijo že odstranjenih možganskih krvnih strdkih pokazali, da precej več teh parametrov lahko določimo iz magnetnoresonančnih (MR) slik, saj smo te strdke slikali z različnimi metodami slikanja MR mikroskopije. Pokazali smo tudi, da obstaja šibka korelacija med trajanjem odstranitve strdka in nekaterimi parametri, pridobljenimi iz MR slik. Rezultati te študije so bili objavljeni v članku Jerneja Vidmarja, Francija Bajde, Zorana Miloševiča, Igorja Kocijančiča, Mirana Jeromela, Igorja Serša, Retrieved cerebral thrombi studied by T2 and ADC mapping preliminary results, Radiology and oncology, 2019, 53, no. 4, 427−433.
Kmalu po uvedbi nove nelinearne supre-ločljive mikroskopijev letu 2017, s katero smo lahko opazovali spremembe supramolekularnih struktur v živih sistemih, in zaradi močne vpetosti v H2020 projekt SmartNanoTox, smo sodelavci Laboratorija za biofiziko uspeli objaviti članek v reviji z visokim IF, ki je prvi tak članek po dolgih letih. V njem (Nano Lett., 2018, 18 (8), pp 5294–5305) smo s STED mikroskopijo lahko prvič direktno opazovali lipidno ovijanje v živem pljučnem epiteliju. Prej smo to lahko z velikim težavami opazovali zgolj indirektno. Omenjena študija je sprožila plaz zanimivih raziskav, vključno s proteomsko analizo omenjenih lipidnih ovojev, ki smo jo opravili v okviru SmartNanoTox konzorcija, točneje s skupino Davida Gomeza na UCD (Dublin, Irska). Ta analiza je odkrila, da so v lipidnih ovojih mnogi protein, katerih premikanje po epiteliju lahko interferira z znanimi signalnimi procesi. V članku v Nano letters smo obdelali enega od the procesov in sicer koagulacijo. Proteimika pa je odkrila še možne interference z razpadom lizosoma, mreže mitohondrijev in citoskeleta, kar smo opazovali s STED mikroskopijo v živo v letu 2018. Odkrili smo zanimive pojave kot posledica privlačne interakcije med površino nanomaterialov in supramolekularnimi strukturami kot so vlakna aktina in tubulina ter membrane mitohondrijev, endosomov in lizosomov. Člani skupine smo se usmerili v študij dinamike, sil in korelacij z znanimi procesi kot so endocitoza, prenos snovi znotraj celice ter vnos v lizosome, kjer sicer celice poskušajo uničiti nanodelce – jasno neuspešno. Rezultat teh interakcij so nove strukture, ki smo jih odkrili, v obliki kompleksov ostankov celičnih organel in nanomaterialov. V prihodnjem letu bomo poskušali zbrati več dokazov, da te structure rastejo znotraj celic, preden slednje preidejo v fazo apoptoze.
Za izboljšanje razumevanja prvega stika med nanomateriali in površino pljučnega epitelija smo v Laboratoriju za biofiziko začeli razvijati živa umetna pljuča, ki posnemajo vdih zraka, onesnaženega z nanomaterialom. Eden od problemov, ki jih obravnavamo v našem laboratoriju, je namreč razpad plasti površinsko aktivnih snovi, ki ločuje sloj epitelijskih celic v pljučih od zraka. Vdih onesnaženega zraka simuliramo z nebularizacijo nanomateriala in je izvedena v posebnem inkubatorju, ki omogoča spremljanje celične in surfaktantske plasti s super-resolucijsko STED mikroskopijo v živo medtem, ko je le-ta izpostavljena nanodelcem. Ker so nanomateriali prisotni kot posamezni delci kot tudi v agregirani obliki, je potrebno uporabiti mikroskopijo z izjemno lokalizacijo v vertikalni smeri. V ta namen uporabljamo drugo modaliteto nove opreme: dvofotonsko STED mikroskopijo (v času nakupa je bila to edina tovrstna komercialna naprava na svetu), ki nam omogoča opazovanje ťnano dežjaŤ od strani. Za kolokalizacijo nanomateriala s površinsko aktivnimi beljakovinami SP-B in SP-C je ekipa stopila v stik s skupino Jesusa Pereza Gila z Univerze v Madridu (Španija), ki nam bo zagotovila posebno označevanje prej omenjenih beljakovin.
Da bi lahko sledili nanodelcem v živem organizmu, morajo nanodelci imeti fluorescenčni signal. V preteklem letu je ekipa Laboratorija za biofiziko uvedla in optimizirala način označevanja TiO2 nanodelcev, ki je primeren za kovinske okside na splošno. Ta protokol vsebuje pomemben korak, ki temelji na znanju osvojenem v sodelovanju s skupino profesorja Christiana Eggelinga iz Univerze v Oxfordu (Velika Britanija). Ta korak temelji na fluorescenčni korelacijski spektroskopiji (FCS), ki jo lahko izvedemo tudi na našem mikroskopu STED. FCS se uporablja za potrjevanje učinkovitosti označevanja in desorpcije sonde po označevanju. Poleg protokola za označevanje je naša ekipa odkrila, da lahko (vsaj nekatere) nanostrukture TiO2 posnamemo brez označevanja z uporabo “time-gated”mikroskopije. Trik izvira iz dejstva, da nekatere TiO2 strukture šibko fluorescirajo. Običajno je ta fluorescenca tako hitra, da običajni detektorji zajamejo dovolj svetlobe. V našem primeru so detektorji plazovne fotodiode (APD), ki so dovolj hitri, da zajamejo dovolj fotonov in jih lahko ločijo od njihovo razlikovanje od drugih fluorescenc, kot sta npr. avtofluorescenca in fluorescenca, ki izvira iz nespecifičnega označevanja. Ta rezultat sta Evropska komisija in uradnik SmartNanoTox projekta pri vmesni oceni projekta septembra 2018 prepoznala kot enega najpomembnejših rezultatov evropskih projektov povezanih z nanotoksikologijo, saj omogoča sledenje nanodelcev TiO2 in vitro, in vivo in ex vivo brez označevanja nanodelcev.
Za učinkovito označevanje smo načrtovali, sintetizirali in preizkusili serijo novih STEDabilnih fluorescenčnih označevalcev, pri katerih smo še posebej želeli doseči počasno prerazporejanje v notranje celične membrane. Med vsemi smo izbrali dve probi, ki jih bomo v letošnjem letu optimizirali za doseganje največje ločljivosti, stabilnosti ter najpočasnejšega prerazporejanja. Poleg tega smo načrtovali tudi dvojne probe za nano-temperaturno mapiranje, s čimer želimo izmeriti temepraturne profile znotraj živečih celic, še posebej znotraj mitohondrijev, kjer je povišana temepratura pričakovana glede na evolucijske prilagoditve nekaterih tam-lociranih enzimov.
V sodelovanju s Skupino za biološko fiziko na Univerzi Carnegie Mellon v Pensilvaniji, ZDA, smo preučevali fazno obnašanje in strukturo lipidnih modelnih membran iz sfingomielina (SM) z uporabo rentgenske difrakcije. Kljub biološkemu pomenu SM je na voljo veliko manj strukturnih informacij za SM v primerjavi z glicerofosfolipidi. Rezultati so pokazali prisotnost t.i. “ripple” (valovite) faze za jajčni SM in palmitoil SM za relativno široko temperaturno območje pod temperaturo glavnega faznega prehoda. To je v nasprotju z običajno predpostavko, da se SM nahaja v gelski fazi pod glavnim faznim prehodom. Zato te ugotovitve kažejo na nujnost ponovne interpretacije strukturnih rezultatov dobljenih na fiziološko pomembnih modelih lipidnih splavov, ki vsebujejo SM kot eno izmed lipidnih komponent. Poleg tega bodo dobljeni profili elektronske gostote v tekoči fazi omogočili razvoj izboljšanih polj sil za simulacijo molekularne dinamike.
S sodelavci Univerze v Oxfordu (Velika Britanija) smo pokazali, da je lebdenje celic T v hidrogelu edini način mikroskopskega opazovanja, ki prepreči njihovo aktivacijo. Pri tem smo uporabili superločljivo fluorescenčno mikroskopijo STED, izsledke pa objavili v ugledni reviji Nature Immunology. S superločljivo fluorescenčno korelacijsko spektroskopijo (STED-FCS) smo nadalje pokazali, da je počasna difuzija proteinov v membranski ovojnici virusov predvsem posledica njene sestave in ne ukrivljenosti.
Slika 1: Našli smo logično povezavo med vdihovanjem nanodelcev (rdeče), lipidniim (zeleno) ovijanjem ter proženjem koagulacijske kaskade v pljučnem epiteliju, kjer smo ključne eksperimente izvedli na STED super-ločljivem mikroskopu in TEM mikroskopu (IJS, Ljubljana/Slovenija) ter z novimi metodami proteomike na UCD (Dublin/Irska). Delo je bilo objavljeno v Nano Letters.
Uporaba magnetne resonance v lesarstvu. Slikanje z magnetno resonanco je zelo učinkovita metoda sledenja vode v bioloških sistemih, med te gotovo sodi tudi les. Voda ima velik vpliv na lastnosti lesa, posebno na cikle dinamike vlaženja lesa, ki vplivajo na les v zunanjih aplikacijah. Zato je pomembno razumeti prodiranje in porazdelitev vode v lesu. V sodelovanju s sodelavci iz Oddelka za lesarstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani smo naredili študijo v kateri smo simulirali padavinski dogodek z enournim potapljanjem vzorcev v vodo. Uporabili smo različne lesne vrste, ki imajo različne vodoodbojne lastnosti in so komercialno najpomembnejše lesne vrste v srednji Evropi. Po končanem potapljanju smo vzorce slikali z MR. Meritve smo uporabili za spremljanje porazdelitve vode in za osvetlitev sprememb, ki nastanejo med sušenjem lesa. Iz teh meritev je bil objavljen znanstveni članek: Mojca Žlahtič Zupanc, Urša Mikac, Igor Serša, Maks Merela, Miha Humar. Water distribution in wood after short term wetting. Cellulose, ISSN 0969-0239, First Online 09 November 2018, https://doi.org/10.1007/s10570-018-2102-y.
Uporaba magnetne resonance pri raziskavah baterij. Zaradi vse večjega števila mobilnih naprav je nujen razvoj zmogljivejših baterij. Pri tem nam lahko pomaga MRI metoda, ki omogoča spremljanje rasti dendritov v baterijah, ter z uporabo posebne MRI metode CD-MRI tudi spremljanje električnega toka med njenim delovanjem. Vendar baterije vsebujejo kovinske dele (elektrode), ki v MR sliki povzročijo motnje. Zato smo na modelnem vzorcu baterije testirali vpliv kovinskih elektrod na MRI signal v različnih orientacijah glede na smer statičnega in radiofrekvenčnega magnetnega polja, ter določili optimalno orientacijo elektrod pri kateri so motnje praktično zanemarljive. Rezultate smo objavili v članku: Serša Igor, Mikac Urka. A study of MR signal reception from a model for a battery cell. Journal of magnetic resonance, ISSN 1090-7807, 2018, 294, str. 7-15.
Slika 2: Vpliv orientacije modelne baterije glede na magnetni polji B0 in B1 na zmanjšanje signala iz področja elektrodama baterije. Kot je prikazano na vstavku nad MR slikami, je bila baterija vrtena v korakih po 15° okoli osi vzporedne s poljem B0 od q = 0° do q = 165°. V začetni orientaciji (q = 0°) so bile elektrode vzporedne B1 polju, tako da ni bilo RF-induciranih vrtinčnih tokov. Ko povečamo q se začnejo pojavljati RF-inducirani vrtinčni tokovi, ki vodijo do obsežnejšega zmanjšanja signala. To je najmočnejše pri q = 90° (polje B1 je pravokotno na elektrode) in se ponovno zmanjša, ko q doseže 180°.
Magnetnoresonančno slikanje deformacijskega tenzorja. Možnost natančnega merjenja sprememb faze pri metodi slikanja z magnetno resonanco omogoča med ostalim tudi merjenje zelo majhnih pomikov v smeri vklopljenega gradienta magnetnega polja. V laboratoriju za slikanje z magnetno resonanco smo pokazali, da lahko z uporabo metode slikanja s spinskim odmevom, ki mu dodamo še bipolarni par gradientov (metodo PGSE) lahko merimo premike z natančnostjo 0.7 ľm. S poskusi na modelnem vzorcu smo pokazali, da lahko s to metodo slikamo tudi deformacijski tenzor. Rezultati teh meritev so bili objavljeni v članku Serša Igor. Magnetic resonance imaging of strain in elastic gels. Journal of applied physics, ISSN 0021-8979, 2019, 125(8), str. 0825211–082521-9.
Slika 3: Slike treh komponent deformacijskega tenzorja: εyy, εzz, in εyz. Komponente deformacijskega tenzorja smo izračunali iz slik pomikov uz in uy, ki smo jih dobili z merjenjem sprememb faze signala, ki jih je povzročil premik vzorca.
Simulacije translacijske dinamike verižnih delcev skozi sluznico. Gosta sluz predstavlja eno od najpogostejših ovir pri ciljni dostavi zdravil in lahko znatno zmanjša izid farmakoloških terapij. Razumevanje transportnega mehanizma skozi sluz je še posebej pomembno za razumevanje bolezni, kot je na primer cistična fibroza, in njihovo zdravljenje. V študiji smo uporabili model fluktuacije vezi (BFM) in z njim analizirali učinek steričnih interakcij na upočasnitev translacijske dinamike sestavljenih verižnih delcev pri prečenju sluzi, ki je bila modelirana z različno konfiguracijo steričnih ovir. Razviti matematični model je upošteval geometrijsko pogojene sterične interakcije kot tudi medverižne sterične interakcije. Predstavljeni model je generičen in ga lahko uporabimo tudi za proučevanje translacijske dinamike kompleksnejših delcev, kot so na primer dendriti ali verižni nanodelci. Rezultati študije so bili objavljeni v članku Bajd Franci, Serša Igor. A bond-fluctuation model of translational dynamics of chain-like particles through mucosal scaffolds. Biophysical journal, ISSN 0006-3495, 2018, 114(11), str. 2732-2742.
Click to edit text. Focus on how you can benefit your customers.
